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荧光原位杂交技术fish检测技术及应用
发布时间:2019-04-09   点击次数:72次

    荧光原位杂交技术fish检测的详细介绍:

  荧光原位杂交(FISH)技术检测组织中的DNARNA序列,那他能不能检测microRNAs呢?提到miRNAs,我们首先想到的是他们非常。?肥邓?鞘呛芏痰牡チ滁/span>RNA分子,只有18-23个核苷酸。由于他们很。??远狱/span>FISH技术的可行性有很多担忧,比如探针能否具有足够的敏感性和特异性,什么样的探测系统适合于来自这些短的目标序列的信号等等。

  miRNAsFFPE组织中的完整性

  很有趣的是,研究表明相比于mRNAs, miRNAs在福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)中能够更好地保存。正是因为他们的体积小, 可以和大的蛋白复合物紧密结合,使得它们能够忍受这个过程。不过,需要一直保持没有RNAse污染的环境,经常我们会使用DEPC水来准备溶液。当然,实验需要的任何器具都需要提前进行高压灭菌。

  荧光原位杂交技术fish检测抗原修复

  经过福尔马林固定交联会限制探针和试剂,使它们不能接近目的miRNAs,可以用抗原修复术来暴露这些位点。大多数protocols会使用含有蛋白酶K tris缓冲液中来打破甲醛交联,也有一些报告,蛋白酶K可能会破坏一些抗原表位,建议在柠檬酸缓冲中加热样本。这两种方法都会有效, 可以探索哪种更适合自己的样本。

  荧光原位杂交技术fish检测探针选择

  曾经有人探索使用标记的核酸探针进行miRNAsFISH实验,但由于目标序列太短,双链稳定性差,而且与紧邻的相关miRNAs有很高的序列相似性,使得很难达到足够的特异性。现在我们通常使用表现更好的Locked DNA(LNA)探针来实现这一过程。

  Locked DNA是一类DNA类似物,糖环上被锁定在一个亚甲基桥,使得探针在N构象稳定,因此LNA探针是结合的佳选择, 它们在更高的温度下实现更高的亲和力和稳定性。完全匹配的双链和错配之间所需温度不同,所以更容易找到一个杂交温度可以只检测的完美匹配,而且,LNA/miRNA杂交体可以抵抗核酸酶的攻击。

  对照探针

  确保使用阳性和阴性对照探针,特别是设置程序时。阳性对照是检测存在于特定组织中的miRNA,阴性对照设置两个探针,其中一个含有两处错配,另一个是针对你所要检测的组织中已知的不会表达的miRNA具有特异性。如果你难以区分背景噪音的信号,你应该还设置一个‘no probe’对照.

  荧光原位杂交技术fish检测杂交和洗涤

  先在50°C进行两个小时的预杂交,然后再与探针进行杂交过夜,温度也是在50°C. 之后进行严格的洗涤步骤,这是去除非特异性反应的关键步骤。洗涤是在SSC缓冲液中,先是在37°C进行洗涤, 以去除多余的探针和杂交缓冲液,然后在50°C进行振荡洗涤,以消除非特异性和重复性的杂交。如果非特异性结合仍然是一个问题,试着重复洗几次。如果你刚刚开始实验,可以探索下不同的杂交和洗涤温度,可能上下两度的的差异会带来很大的不同。

  荧光原位杂交技术fish检测探针标记和信号检测

  市场上有很多种寡核苷酸标记示踪剂以供选择。生物素被用作5’端耦合,适合进行免疫组化检测。如果你的组织是丰富的内源性生物素,dioxigenin应该是你的第一选择。结合anti-label抗体后,用辣根过氧化物酶系统将信号放大。还可以选择一个合适的荧光基团为HRP底物,常使用的是花青染料, Alexa系列或Quasar染料也是一种选择。根据所需的ex/em,双标等选择合适的标记。

    荧光原位杂交技术fish检测FFPE组织中miRNAs有很多优势,可以使miRNAs在复杂组织中的确定位置形象化地体现,可以进行大量样本的检测。随着科学发展,还可以同时检测蛋白质标记的miRNA,以及多元miRNA FISH技术。无论在癌症领域还是发育生物学领域,miRNA研究都是具有无限潜力的!

       1对于荧光原位杂交技术fish检测操作来说,那些因素比较重要?

  在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率;光照影响了荧光染料的强度,因此探针要避光保存,其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片且避光保存;各种试剂pH也要精确达到要求,这也直接关系到FISH的稳定性。

  2 如何保证荧光原位杂交技术fish检测操作中的温度?

  措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作,如VysisHybrit FISH杂交仪。如果是手工操作,首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查,如水浴锅、孵箱,对其中不符合要求的要进行更换(疾病诊断中的探针要求温控精度在0.5度以内)。其次,要尽可能地保持操作环境温度在20度以上,对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂,在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度,诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季,盖玻片本身温度就低,加之探针的量本就不多(10ul),因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的要进行预热处理,不然会影响FISH的杂交效果。

  3 使用荧光显微镜观察结果时,最初有清晰而明亮的信号,但随后信号急剧衰减,几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗?

  正常情况下,商业化探针即使是杂交后,如保存适当,荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭,从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时,尽可能在暗室中操作,也可以在封片观察时加入一定的antifade(抗淬灭剂)以延缓荧光素的淬灭。

  4 如何配制荧光原位杂交技术fish检测各种试剂呢?

  强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂。此外,配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级要求。每次FISH使用新的试剂,旧的试剂好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。

  5 荧光原位杂交技术fish检测直标型探针和间标型探针有何不同?

  为什么我们要选择直标型探针?所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接荧光素基团;间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接,诸如生物素或,然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗原-荧光素基团,类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比,直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展,直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域,尤其是在疾病分型领域,探针大多采用直标型设计。

  6 能对同一样本进行多次的荧光原位杂交技术fish检测操作吗?

  在多数情况下,如果FISH操作没有得到正常的结果,我们可以将探针洗去,然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针,还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本,处理方法略有不同。外周血样本的处理: 1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片 2、将样本片浸泡于70%、85%和100%的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半,但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交,变性的时间就无需减少了。对于多次杂交,复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作:将样本片浸泡于70%、85%和100%的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半,但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交,变性的时间就无需减少了。

  8 荧光原位杂交技术fish检测技术有哪些主要优势:

 、攸/span> 安全、快速、灵敏度高;

 、冱/span> 探针能较长时间保存;

 、邳/span> 多色标记,简单直观;

 、埸/span> 可用于中期染色体及间期细胞的分析;

 、茳/span> 可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。

      荧光原位杂交fish检测 应用在医疗行业:

荧光原位杂交技术fish检测(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性,荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来,通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交,在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数,从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断,为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末,PinkelHeilesFISH技术引入染色体检测领域后,FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用,显示出与一些传统技术相比的明显优势。

  荧光原位杂交fish检测与传统的免疫组织化学法(IHC)相比,FISH具有良好的稳定性和可重复性。目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大(例如酸、碱和变性剂),检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外,免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断,对于一些弱阳性的结果,不同的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。

  荧光原位杂交技术fish检测检测的对象是细胞中的DNA,致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良好,其结构稳定,不易被环境条件影响,为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此外,荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数,客观地量化了检测地结果。如果借助于相应的FISH操作系统(例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000样本预处理系统)和染色体成像系统(例如AI公司的CytoVision)就能实现整个FISH操作的自动化,最大限度的降低操作者和检测者的主观因素,确保结果的准确性。

  PCR由于灵敏度高,操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术,但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高,对同一样本也只能作一次分析,不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展,FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水平,并能很好弥补PCR技术的局限。荧光原位杂交技术fish检测不仅有极低的假阳性、假阴性的比例(以Abbott-Vysis的产前诊断探针为例,29,000例的使用结果证实正确率高达99.9%),还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常,大大节省了检测的时间。此外,通过FISH可以对染色体或特定基因的数目异常,特定片断的缺失、易位和重排进行诊断研究。

  荧光原位杂交技术fish检测目前已经广泛应用在产前及植入前、肿瘤的预前和预后以及血液类疾病的诊断分型领域。

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