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做好 Western Blot,这几个操作技巧很关键。
发布时间:2019-04-08   点击次数:154次

    Western Blot 操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,从试剂与设备的选择到实验条件的摸索,都很关键。如果初学者想要做好 Western Blot,记住以下的操作技巧,或许能够事半功倍。

   一、蛋白质的样品制备:

    蛋白质在样品处理过程应在低温下进行,以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(加入合适的蛋白酶抑制剂)。

    样品建议分装成合适的量(比如分装出 20μL 检测蛋白质定量用),然后 -20°或 -80℃中长期保存,注意不要反复冻融,因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

    切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。

   二、蛋白质定量:

    如果要定量的话,一般选择 BCA 或者 Bradford 方法,BCA 要求检测波长为 562nm,Bradford 为 595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果,建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马 G250 混合看是否产生颜色。

    按分子克隆的说法,还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过 15μL,加样孔的最大限度可加 20μL 样品。

    上样前要将样品置于烧杯内,在沸水中煮 3~5min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪 95℃ 加热 5min,效果佳,操作方便。之后样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存,也可在 -20℃ 冰箱保存数月,切勿反复冻融。

   三、SDS-PAGE电泳:

    未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。

    灌胶时掌握好速度,避免气泡产生(注意浓度越小的胶含水越多,凝固后胶体积缩小越多)。加水液封时速度要很慢,否则胶会被冲变形。

    聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定,通常在 30min 左右,AP 不新鲜会导致聚合变慢,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量,但通常不会超过 1h,若超过 1h 甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。推荐 APS 每周新鲜配置。

    取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer(事前分装好,每次从冰箱里取一管即可),95~100℃ 加热 5min,若有沉淀可用稍低温度,比如 45~55℃ 加热  1h 达到变性的目的。

    加样前可用 5mL 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。加入下一个样品前,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次,以免交叉污染。上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。

    电泳时间和电压说法各异。一般电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。

   四、转膜:

    我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90kd 以下的蛋白,转膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037% 的 SDS 。

    切滤纸和膜时一定要戴干净手套,因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min~2min。

    在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸,平衡 10min左右,也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

    用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动,除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡,因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

    用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干。这一步很重要,宁可太干也不能太湿,太干容易烧胡,太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路,大大降低转移效率,如果同时转好几条胶的时候更要小心,有一个胶短路就会影响整体的转移效率。

   五、免疫杂交反应:

    如果是自己配置的封闭液,应过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜,不如一抗孵育过夜。

    一抗一般用封闭液稀释即可,如果背景不高用 TBST 稀释也可以,熟练后还可以配制一些自己的复方稀释液,用后可回收重复用 2~3 次,但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量,分装的抗体不推荐回收。

    二抗作用的时间应严格控制,实践证明一抗时间长点可能没什么关系,而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤,否则显影是背景可能脏。

    最后是化学发光(ECL),显影,定影以及凝胶图象分析的步骤,一般来说按照说明书来操作,在此不多赘述。 

 

 

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