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荧光定量Q-PCR检测知识“大攻略”!
发布时间:2019-03-18   点击次数:75次
   荧光定量Q-PCR检测知识“大攻略”!
  荧光定量Q-PCR检测的理论依据是什通过特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的。
  理想的扩增结果:Y=X×2n;
  其中Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y=X(1+E)n,其中E代表扩增效率:E=参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1-105拷贝、循环次数n≤30时,E相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期。
  荧光定量Q-PCR检测的理论模式:
  PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
  PCR扩增通式:
  1.Tn=T0(1+E)n;
     2.Tn=Tn-1(1+E)n。
  注:[0其中E表示扩增效率,n为循环数,Tn表示在n个周期后PCR产物的数量,Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量,T0为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时,产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在1010左右)高于背景为仪器所识别,此时的循环数为CP,也就是K=T0(1+E)CP,取对数即:
  lg K=lg T0+CP*lg(1+E);
  CP=-1/lg(1+E)*lg T0+lgk/lg(1+E)。
  由于对一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对数(lg T0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E),在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E),也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。
  根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分为四种类型:
  直接定量检测法;同位素标记定量;酶标记定量检测法;荧光定量Q-PCR技术。
  荧光定量PCR主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光,同时将供体荧光淬灭。
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